Писаржевський С.А.
C таршійнауковий співробітник, Інститут Атеросклерозу [email protected]
1.Ендотеліальние клітини.
Ендотелій бере участь як у фізіологічній регуляції судинного тонусу, так і в структурної трансформації судини при патологічних умовах. При фізіологічних умовах ендотеліальні клітини постійно секретують окис азоту (NO), яка розслаблює гладком'язові клітини і забезпечує розкрите стансудин. Пошкоджені або надмірно активовані ендотеліальні клітини можуть також секретувати вазоконстрикторного фактори, найбільш відомим з яких є ендотелін - 1 (ЕТ - 1), як і фактори, що впливають на диференціювання і зростання судинних гладком'язових клітин. Як пошкодження ендотеліальних клітин вносить внесок при патологічних умовах у хворобу судин найкраще ілюструється на прикладі пацієнтів з diabetes mellitus, у яких спостерігаються виражені зміни в структурі тафункції ендотеліальних клітин. Ендотеліальні клітини також реагують з клітинами в кров'яному руслі, ЕТ-1 та інші фактори звільняються з ендотеліальних клітин у кров, де їх хемотаксичні дія може індукувати лейкоцити і тромбоцити мігрувати в судинну стінку. Ендотеліальні клітини індукують адгезію шляхом експресії специфічних молекул адгезії (селектіни, інтегринів і супергенное сімейство імуноглобулінів), які можуть взаємодіяти з лігандами налейкоцитах і тромбоцитах. Експресія молекул адгезії збільшується в ендотеліальних клітинах, які піддаються хронічному пошкодження факторами ризику атеросклерозу. Порушена проникність ендотеліального шару у пацієнтів з diabetes mellitus і /або гіперліпідемією веде до збільшеного притоку субстанцій з циркуляції в судинну стінку. Крім того, дисфункція ендотеліальних клітин може вести до прискореного внутрішньосудинного згортання крові. Очевидно, що ендотелій відіграє центральнуроль у багатьох ранніх патофізіологічних процесах, що беруть участь в атеросклерозі. Тому важливо вивчити ефекти антиатеросклеротической терапії на функцію ендотеліальних клітин і міжклітинні взаємодії. До недавнього часу мало було відомо про прямі ефекти антогоніст кальцію на функцію ендотеліальних клітин. Недавні дослідження показали, що вони в основному впливають на взаємодія ендотеліальних клітин, гладком'язових клітин, моноцитів і тромбоцитів, щовідіграє центральну роль на ранніх стадіях розвитку атеросклерозу, в той час як протективний ефект цих агентів на судинну систему виявляється малий на пізніх стадіях /20 /.
Таким чином, ендотелій відіграє важливу роль, як у фізіології, так і патології судин, при цьому особливе значення мають порушення проникності ендотелію і секреція ендотеліальними клітинами молекул адгезії.
2.Соединение між клітинами ендотелію.
Зв'язки між клітинами ендотелію є складними структурами, утворені трансмембранними адгезивними молекулами, сполученими з мережею цитоплазматичних /цитоскелетних білків. Існує, принаймні, три різних типи ендотеліальних сполук: щільні з'єднання, щілинні з'єднання і з'єднання-зчеплення. Ці структури мають деякі риси і компоненти, спільні з епітелієм, але деякі специфічні для ендотелію. Відомо дуже мало про патологічні наслідкизмін у функціональному стані або синтезі білків з'єднань ендотеліальних клітин. Можливо, що патології, пов'язані зі зміненою ендотеліальної проникністю і організацією судин (гемангіома, склеродермія та інші типи васкулітів) пов'язані зі структурними змінами в організації з'єднань ендотеліальних клітин. Крім того, зміни в ендотеліальної проникності пов'язані з ранніми стадіями атеросклерозу і багатьма запальними хворобами /62 /.
Таким чином, зв'язки між ендотеліальними клітинами є складними структурами, що грають важливу роль в різних судинних патологіях.
3.Мікротубули і мікрофіламенти
Ендотелій - це метаболічно активний монослой клітин, регулює безліч фізіологічних і патологічних функцій, які визначають його проникність і тромборезістентних властивості. Структура і функція ендотеліального цитоскелету запобігає судиннухвороба, оскільки він є молекулярним бар'єром для атерогенних білків і джерелом мігруючих клітин, готових відновити пошкодження ендотеліального шару. Цитоскелет є ключовим регулятором в підтримці цілісності ендотелію і відновлення цілісності після ушкоджень, що викликали оголення судини, таких, які відбуваються при патогенезі атеросклерозу. Актинові мікрофіламенти і їх з'єднання: зчеплення і фокальні зчеплення є важливими регуляторами клітинногосигналізування, клітинного руху та механізму загоєння ушкоджень. Різні білки беруть участь у контролюванні заснованої на цитоскелет ендотеліальної функції і загоєння, такі, як тирозин - кінази /фосфатази і Rho сімейство білків. Нормальна функція ендотелію є високо залежною від цитоскелету. Руйнування і дисфункція цитоскелету може бути викликати порушення ендотеліальної функції, відповідно порушуючи баланс на користь судинної хвороби. Тому розуміння клітинної тамолекулярної біології ендотеліального цитоскелету суттєво для розуміння патогенезу судинних хвороб, особливо атеросклерозу /31 /.
Досліджувався питання про те, чи впливає гіперхолестеринемія на розподіл микрофиламентов ендотеліальних клітин протягом ініціації і зростання ушкоджень типу жирових смуг. Пошкодження, що розвинулися протягом 20-тижневого періоду, були класифіковані в чотири типи, засновані на локалізації і ступеня макрофагальної інфільтрації,спостережуваних мікроскопічно. Найбільш ранні пошкодження характеризуються прилипанием лейкоцитів до поверхні ендотелію. Мінімальні пошкодження характеризуються небагатьма клітинами в субендотеліі. Проміжні пошкодження складаються з численних субендотеліаьних лейкоцитів в мінімально піднятому пошкодженні.
Зрілі жирові ушкодження у вигляді жирових смуг підняті і містять декілька шарів лейкоцитів. Організація актину периферичних з'єднань (щільнапериферична стрічка) та центральні ендотеліальні пучки Актинові мікрофіламентів вивчалися в кожному з цих пошкоджень за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Виявлено, що в аорті, поза місцями розгалужень і в областях поза ушкоджень, на розподіл центральних мікрофіламентів не впливала гіперхолестеринемія. Макрофаги входили в стінку без визначної реорганізації микрофиламентов. Протягом акумуляції субендотеліальних макрофагів в мінімальних і проміжних пошкодженнях стресовіволокна спочатку збільшуються в порівнянні з вільними від пошкоджень областями. У піднятих зрілих пошкодженнях центральні мікрофіламенти стають тонше і зникають. Однак, в роздільниках потоків, де центральні стресові волокна в нормі помітні, ендотеліальні клітини на поверхні проміжних ушкоджень демонструють редукцію центральних волокон, а периферичні зв'язки стають видимі. Це супроводжується
змінами у формі клітин від витягнутій добулижнікообразной. Зв'язки Актинові мікрофіламентів в ендотеліальних клітинах зазнають істотні зміни протягом накопичення субендотеліальних макрофагів при формуванні індукованих гіперхолестеринемією ушкодженнях типу жирових смуг. Ці зміни можуть впливати на адгезію до ендотелію, проникність і відновлення після ушкодження /11 /.
Таким чином, цитоскелет є ключовим регулятором в підтримці цілісності ендотелію і ввідновленні цілісності після ушкоджень. Актинові мікрофіламенти в ендотелії змінюються під час накопичення макрофагів під ендотелієм при початкових атеросклеротичних ушкодженнях типу жирових смуг при гіперхолестеринемії. Це може впливати на проникність ендотелію.
4.Кавеоли
Кавеоли - це інвагінації в поверхні плазматичної мембрани від 5 до 100 нм в термінально диференційованих клітинах. Вони особливо численні вендотеліальних клітинах, в яких, як вважають, вони відіграють головну роль у регуляції ендотеліального везикулярного транспорту і сигнальної трансдукції. Використання кавеолін - 1 - дефіцитних мишей дало багато нових ідей для розуміння ролей кавеол і кавеолін-1 в регуляції функції ендотеліальних клітин. Ці нові відкриття примушують припустити важливу роль кавеолін - 1 в патогенезі раку, атеросклерозу і васкулярної хвороби /16 /.
Таким чином, кавеоли,інвагінації в поверхні плазматичних мембран, грають головну роль у регуляції ендотеліального везикулярного транспорту.
5.Ендотеліальная дисфункція
Протягом останніх 10 років стало очевидним, що ендотелій регулює тонус судин, модулює гемостаз, впливає на судинну проникність і контролює ріст кровоносних судин. Роль ендотелію в регуляції судинного тонусу опосередкована звільненням сильних вазоактивних речовин,включаючи відбуваються з ендотелію релаксуючі фактори (один з яких або окис азоту, або речовина, що вивільняють окис азоту), вазоактивні простагландини, що виділяється ендотелієм гіперполярізуется фактор і фактори констрикции (такі як тромбоксан А2 ендотелін, супероксид аніон, L - аргінін-залежні продукти та ін.) Ця роль ендотелію драматично змінюється декількома хворобами, включаючи diabetes mellitus, цереброваскулярні хвороби і т.д. Ненормальності ендотеліальної регуляціїсудинного тонусу можуть вносити вклад в клінічні синдроми, включаючи атеросклероз, гіпертонію, септичний шок і багато інших. Ендотеліальна дисфункція, яка характеризується зміненим синтезом або звільненням цих релаксуючих факторів разом з підтриманням або посиленням синтезу або звільнення факторів контракції, може привести до різних патологічних явищ, таким, як тромбоз, Спазм судин і гіпертонія. Краще розуміння точноїприроди ендотеліальної дисфункції, включаючи роль відбуваються з ендотелію вазоактивних факторів, може забезпечити базис для нових методів терапії при цих судинних патологіях /34 /.
Здоровий ендотелій відіграє центральну роль у контролі за серцево-судинною системою. Тому ендотеліальна дисфункція (ЕД), яка характеризується дисбалансом між факторами релаксації і контракції, прокоагулянтнимі і антикоагулянтними субстанціями і між прозапальних іантизапальними медіаторами, може грати особливо істотну роль у патогенезі атеросклерозу. Ендотеліальна дисфункція тісно пов'язана з різними факторами ризику атеросклерозу, інтенсивністю і тривалістю їх дії. Участь факторів ризику в ЕД також доводиться результатами досліджень, які показали регресію ЕД при лікуванні факторів ризику. Оскільки дія факторів ризику зазвичай супроводжується зменшенням біодоступності окису азоту, загальнимзнаменником різних факторів ризику, що викликають ЕД по всій ймовірності є окисний стрес. ЕД може сприяти атерогенезу через різні механізми, такі, як збільшене зчеплення моноцитів, макрофагів і зросла проникність ендотеліального шару. Далі, ЕД ймовірно грає важливу роль в зростанні атеросклеротичних уражень і в розвитку тромботичних ускладнень на пізніх стадіях хвороби. Оскільки ЕД є ключовим фактором атеросклеротичного процесу, проводився пошукмаркерів ендотеліальних аномалій. Оцінка ЕД засноване на тестах за визначенням ендотелій - залежної рухливості судин (здатність до розслаблення периферичних і коронарних артерій) та циркулюючих маркерів ендотеліальної функції (ендотелін - 1 фактор von Willebrand, тканинної активатор плазміногену, інгібітор активатора плазміногену і молекули адгезії). Використовуючи ці тести, можливо, визначити дозовую залежність шкідливих ефектів факторів ризику і ефектипревентивних процедур на функцію судинної стінки /45 /.
Ендотелій є головним регулятором судинного тонусу, звільняючи судинозвужувальні (ендотелін, циклооксигеназа-залежні фактори, включаючи простаноїди і кисневі вільні радикали) і судинорозширювальні (генерується ендотелієм окис азоту, що генерується ендотелієм фактор гіперполяризації) медіатори. Ці біологічекі активні субстанції контролюють не лише судинний тонус, але й структуру та проникністьсудини, згортання і фібриноліз, також як і запальний відповідь судинної стінки. При ендотеліальної дисфункції баланс продукції ендотелієм судинорозширюючих і судинозвужувальних субстанцій змінюється, в результаті чого зменшується ендотелій - залежна релаксація. Ендотеліальна дисфункція є важливою подією в патогенезі ранньої стадії атеросклерозу і гіпертонії. Тестування і моніторування ендотеліальної дисфункції включає тести ендотелій-залежної рухливості судин, також як іциркулюючих маркерів ендотеліального ушкодження. Потрібен пошук методів для побудови системи тестів для вимірювання ступеня ендотеліальної дисфункції (= субклінічній атеросклерозу), ступеня ризику і відповіді на терапію /39 /.
Ендотеліальні клітини виконують багато фізіологічні функції, включаючи регуляцію судинного тонусу, регуляцію гемостазу і фібринолізу, регуляцію запальних процесів і підтримання бар'єру проникності для забезпеченняобміну та активного транспорту субстанцій в артеріальну стінку. Патофізіологічні стимули можуть призводити до локальних змін в активності ендотелію. Ці зміни включають підвищену проникність для плазмових ліпопротеїнів, імбаланс локальних тромбогенних субстанцій, що веде до протромботичних станом, і звільнення вазоактивних речовин, що призводить до вазоконстрикції. Втрата ендотелій - залежної вазодилятації вважається раннім подією, що веде до атеросклерозу і відбуваються ще дотого, як морфологічні зміни в ендотелії можу бути виявлені. Багато з ефектів здорового ендотелію виробляються окисом азоту. Зменшена доступність окису азоту призводить до ендотеліальної дисфункції, яка є першим кроком атеросклеротичного процесу. Модіфіцація факторів ризику та фармакологічне втручання, які можуть звернути ендотеліальну дисфункцію, можуть зменшити кардіоваскулярні події у пацієнтів з ризиком /2 /.
Надмірна продукціясупероксидних аніонів в судинній стінці вносить вклад в ендотеліальну дисфункцію при судинної хвороби. Генеруюча супероксид відновлена бета - нікотинамід динуклеотид фосфат (NADPH) оксидаза була недавно ідентифікована як основне джерело окислювальних радикалів в судинних тканинах. Вивчалися ефекти синтетичного з'єднання, що імітує магній - містить супероксид дисмутазу (СОД), M40403 на залежну від NADPH оксидази продукцію супероксиду і на ендотеліальну дисфункцію.У щурів в гладком'язових клітинах аорти NADPH (100 мікро M) суттєво стимулюють продукцію супероксиду. Це було визначено за допомогою
хемілюмінесцентного тесту з люцігініном. M40403 зменшує NADPH оксидаза - залежну продукцію супероксиду в залежності від концентрації. Ангіотензин 11 збільшує активність NADPH оксидази, а обробка M40403 (10 мікро М) зменшує збільшений рівень супероксиду до контрольного рівня. В аорті аполіпопротеїн - дефіцитних мишей з гіперліпедеміей іатеросклерозом продукція супероксиду в основному визначається
NADPH оксидазу. Виснаження ендотеліальної продукції окису азоту йде паралельно зі збільшенням освіти супероксиду в судинах на різних стадіях хвороби. Аортальні кільця з M40403 істотно пригнічують продукцію супероксиду і покращують ендотелій - залежне розслаблення судин до рівня порівнянного з тим, який спостерігається у контрольних мишей дикого типу. Сумарно проникаючий у клітини імітує СОДM40403 призводить до реверсії ендотеліальної дисфункції у аполіпопротеіндефіцітних мишей ex vivo шляхом зменшення NADPH оксидаза - залежного рівня супероксиду. Переваги синтетичного СОД миметики в порівнянні з нативним Cu /Zn СОД ензимом, такі, як збільшена клітинна проникність і стабільність, мають значний терапевтичний потенціал для лікування судинної хвороби /27 /.
Таким чином, ендотеліальна дисфункція, яка характеризуєтьсядисбалансом між факторами релаксації і контракції, прокоагулянтнимі і антикоагулянтними субстанціями і між прозапальних і антизапальними медіаторами, може грати особливо істотну роль у патогенезі атеросклерозу.
Надмірна продукція супероксидних аніонів в судинній стінці вносить вклад в ендотеліальну дисфункцію при атеросклерозі.
6.Фактори, що впливають на проникність ендотелію.
6.1.Общіе питання.
Ендотеліальний бар'єр в усіх органах дозволяє проходити вільному обміну води, але обмежує в різного ступеня транспорт розчинів, таких, як розчин альбуміну. Наприклад, в мікросудинах мозку ендотеліальний бар'єр обмежує транспорт білків, у той час як в мають пори і безперервних ендотеліальних клітинах нирок і в ендотеліальних клітинах легенів ендотеліальний бар'єр напівпроникною. Ендотеліальний монослой демонструє селективність, тобтопроникність молекул універсально пов'язана з молекулярною вагою. Хоча теорія пір була використана для опису транспорту через ендотеліальний бар'єр, транспорт розчинів також залежить від заряду розчинених речовин та ендотеліальних клітин. Рецептор - опосередкований трансцитозу альбумінів може вносити вклад в транспорт альбумінів на додаток до транспорту через парацеллюлярное простір (тобто через так звані пори). Проникність води через ендотелій визначається взаємодієюальбуміну з гликокаликсом і щілинними компонентами ендотелію ("волоконний матрикс"). Концентрації альбуміну в навколишньому середовищі служать для пониження гідравлічної провідності ендотелію. Збільшена проникність ендотелію по відношенню до розчиненим речовин і воді залежить від форми і конфігурації ендотеліальних клітин, що визначаються змінами в елементах цитоскелета, таких, як f-актин, і регулюється внутрішньоклітинними вторинними мессенджерами, такими, як вільний цитозольний кальцій /37 /.
Епідеміологічні та експериментальні дослідження показали, що магній тісно пов'язаний з регуляцією метаболізму ліпідів, структурою і проникністю мембрани, ендокринними гормонами і функцією тромбоцитів. Причиною атеросклерозу, індукованого дефіцитом магнію, як припускають, є зменшення кількості простацикліну, що виділяється ендотеліальними клітинами, і збільшення агрегації тромбоцитів. Виявлено, що плазма від пацієнтів, які страждають від болю в грудяхмістить більш високі рівні оксістероли, ніж плазма пацієнтів того ж віку і статі, не мають болю. Дослідження на культивованих артеріальних клітинах в середовищі дефіцитної по магнію або містить оксістероли показали, що і магній, і оксістероли грають важливу роль в ліпідному обміні у пацієнтів з коронарною хворобою серця /30 /.
Накопичуються дані демонструють, що атеросклероз є імунологічно опосередкованої хворобою. Пошкодження ішемії /реперфузіїміокарда супроводжується запальною відповіддю, що вносить вклад в оборотні та необоротні зміни в життєздатності тканин і функції органів. Визнано три, що вносять вклад в реперфузійного пошкодження, фактора. Це: (1) молекулярний кисень, що виділяється клітинними елементами крові (особливо нейтрофілами), (2) клітинні елементи крові (особливо нейтрофіли), (3) компоненти активованої системи комплементу. Останні два часто діють спільно. Ендотеліальний і лейкоцитарний відповідіберуть участь в ушкодженні тканин, будучи регульовані каскадом комплементу. Анафілатоксин і мембранні атакуючі комплекси вносять внесок прямо або побічно в подальше пошкодження тканин. Пошкодження тканин, опосередкована нейтрофілами, може бути ініційовано фрагментами комплементу, особливо C5a, які є сильними стимуляторами продукції супероксиду нейтрофілами і зв'язування з ендотелієм коронарної артерії. Каскад комплементу, особливо альтернативний шлях, активується впротягом ішемії /реперфузії міокарда. Фрагменти комплементу, такі, як анфілатоксіни C3a і C5a, продукуються як локально, так і системно, і комплекс атаки мембрани поміщається на клітинні мембрани і відбувається подальше вивільнення медіаторів, таких, як гістамін і фактор активації тромбоцитів, що, таким чином, є причиною збільшення судинної прніцаемості з подальшим проявом клітинного набряку. Комплемент збільшує експресію CD18 на нейтрофілах і збільшує експресіюР-селектину на поверхні ендотелію. Мітохондрії можуть бути джерелами молекул, які активують комплемент протягом ішемічного /реперфузійного пошкодження міокарда, забезпечуючи стимул для інфільтрації поліморфноядерними лейкоцитами. Збереження тканини може бути досягнуто шляхом виснаження компонентів комплементу, що робить очевидним внесок каскаду комплементу при ішемічній - реперфузійного пошкодження. Складність каскаду комплементу містить численні місця, які єпотенційними мішенями для терапевтичних втручань, модулюють відповідь комплементу на пошкодження. Прикладом може служити здатність розчинних форм рецептора комплементу 1 (sCR1) зменшувати розмір інфаркту, викликаного ішемічним /реперфузійного пошкодженням у моделях in vitro. Механізм, який ініціює активацію комплементу, не зовсім зрозумілий, хоча втрата CD59 (протектіна з клітин), підданих небезпеки ішемії /реперфузії, може вносити вклад в пряме пошкодження коронарного судинитермінальним комплексом комплементу. Терапевтичні підходи до ішемічного /реперфузійного пошкодження взагалі, і особливо до включає комплемент, тільки починають розроблятися, і їх потенційні переваги все ще не оцінені адекватно. Потрібно зауважити, що активація комплементу має позитивні і негативні ефекти, і тому швидше повинна бути модулювати, чим різко зупинена /6 /.
6.2.Гемодінаміческіе фактори.
6.2.1.Сдвіг(Shear stress).
Краще розуміння того, як гемодинамічні фактори впливають на цілісність і функцію судинного ендотелію, необхідно для розуміння того, як ініціюється і розвивається атеросклероз. Представлена нова техніка для визначення зв'язку між динамічними рідинними характеристиками і проникністю ендотелію для макромолекул. Повністю анестезувати домашнім свиням внутрішньовенно вводили альбумін, мічений блакитним барвником Еванса, якомудозволяли циркулювати протягом 90 хв. Після того, як тварини були вбиті, силіконові препарати були приготовлені з абдомінальної аорти і клубових гілок. Були проведені обчислення пульсуючого потоку в областях, інформація про які була отримана з препаратів. Розподіл розрахованого, залежного від часу shear stress (мається на увазі реакція ендотелію на гемодинамічну розтяг судини і зсув, тобто стрес зсуву або розтягнення) стінки у зовнішніх розгалуженняхклубової артерії було безпосередньо порівняно з обчисленим по точках просторово варьирующим поглинанням барвника Evans голубой в тих же самих артеріях. Результати вказують, що in vivo проникність ендотелію по відношенню до альбуміну зменшується зі збільшенням середнього за часом shear stress по відношенню до нормальних значень . Крім того, проникність ендотелію збільшується незначно в міру осциляції індексу зрізу /23 /.
Гіпотеза, що значна частина поглинання макромолекул судинної стінкою має місце, коли ендотелій пристосовується до змін в гемодинамическом оточенні, була тестована в серії in vivo вимірювань поглинання міченого блакитним барвником Еванса альбуміну в клубових артеріях свині, піддана гострим змін потоку крові. Дані з поглинання були інтерпретовані за допомогою спеціальної ad hoc моделі відповідідинамічної проникності, який, як передбачається, супроводжує зміни в пристеночном шарі. Модель здатна корелювати в одному комплекті параметрів з відповіддю судини при різноманітних експериментальних протоколах, включаючи крокові збільшення і зменшення shear stress в різні періоди. Аналіз найбільш схожий параметрів моделі змушує припустити, що перед адаптивним відповіддю на збільшення зрізу є латентний період приблизно в 15 хв, що істотно менше, ніжпри відповіді на зменшення зсуву /21 /.
Атеросклероз переважно буває в областях з турбулентим потоком і низьким рівнем стресу зрізу, в той час як ламінарний потік і високий shear stress є атеропротектівний. Добре охарактеризований атеропротектівний механізм включає інгібування тромбозу (Збільшений рівень тканинного активатора плазміногену і зменшений рівень інгібітора - 1активатора плазміногену), інгібування апоптозу ендотеліальних клітин, обмеження проникності (поглинання ліпопротеїнів низької щільності), запобігання зв'язування білих клітин крові і трасміграціі (відсутність експресії молекул адгезії, таких, як міжклітинна молекула адгезії - 1[ICAM-1]і судинна клітинна адгезивна молекула - 1[VCAM-1]) і відсутність збільшеною біодоступності окису азоту (через збільшену експресії ендотеліальної синтетази окису азоту і магнієвоїсупероксид дисмутази). Було проведено дослідження опосередкованого потоком інгібуючої дії запальних цитокінів. Встановлено, що потік запобігає опосередковану фактором некрозу пухлин альфа сигнальну трансдукції. Фактор некрозу пухлин регулює експресію запальних генів (тобто ICAM - 1 і VCAM - 1) в ендотеліальних клітинах, частково за рахунок стимулювання мітоген - активованих білкових кіназ, які фосфорилируют транскрипційні фактори. Висунуто гіпотеза, що shear stress потоку інгібує запальні ефекти фактора некрозу пухлин (TNF) на ендотеліальні клітини шляхом інгібування TNF-опосередкованої активації c-Jun N-термінальної кінази. Для перевірки цієї гіпотези визначалися ефекти сталого ламінарного потоку на TNF-стимулюється активність c-Jun N-термінальної кінази. Результати показали, що потік інгібує активацію c-Jun N-термінальноїкінази через множинний механізм, що включає стимуляцію протіворегуляторной MAP кінази (позаклітинні регулюють сигнал кінази[ERK]1/2 і ERK5) і інгібування сигнал - регулюючої апоптоз кінази. Сумарно, атеропротектівний ефект сталого ламінарного потоку на ендотелій включає множинні синергічна механізми. Ці множинні механізми є привабливими мішенями для нових лікарських засобів, спрямованих на обмеження розвитку і прогресування атеросклерозу/3 /.
Метою цього дослідження було зміни індукованої артеріальним проникності для альбуміну в інтимі і супроводжуючі її структурні відповіді в артеріях свині. Однакові ламінарні відповіді shear stress були порівняні з такими областями стресу "поділу потоку". Ці області були створені з використанням спеціально створених утворюють потоки пристосувань в експериментально контрольованих, метаболічно підтримуваних ex vivo препаратахторакоабдомінальної аорти. Зразки проникності для пофарбованого блакитним барвником Еванса альбуміну визначалися рефлектометричним методом. Відповідні структурні тканинні відповіді визначалися за допомогою гістологічної, іммуноокращівающей і ультраструктурної мікроскопічної техніки. Було показано, що коли попередньо адаптована in vivo артерія переноситься в нове механохімічної оточення, в ній відбувається послідовність адаптивних процесів протягом наступних 95годин. Області інтими, які зазнали впливу shear stress (приблизно 16 дин /см (2) в перший період (23 години)) відповідали збільшенням проникності. У міру продовження стресу структурні зміни в інтимі - медії відбувалися таким чином, що відновлювалася нормальна фізіологічна проникність. Протягом того ж самого періоду в. суміжних областях ендотелію, які зазнали стресу полів розділених потоків(Приблизно 003-027 дин /см (2)), спостерігалося раннє і прогресивно збільшується збільшення проникності. Це супроводжувалося формуванням локальної едеми в інтимі, втратою матрикса в інтимі і розвитком виразно піднятих желатіноподобних поразок в інтимі, які мають потенційно преатероматозную структуру /18 /.
Потік через щілини субендотеліальной інтими і медії артеріальної стінки стимулювався кількісно для того, щоб вивчитирозподіл водного потоку через невеликі пори, яке впливає на shear stress в гладком'язових клітин артеріальної стінки прямо під внутрішньої еластичним шаром. Був виконаний аналіз у двох вимірах з використанням моделі Brinkman для потоку в пористому середовищі. Виявлено, що гідравлічна проникність шару інтими повинна бути значно більше, ніж така медії для того, щоб передбачити розумну величину падіннятиску через субендотеліальних інтиму і внутрішній еластичний шар. Коли Ki було встановлено рівним значенню в медії, це падіння тиску виявилося нереалістично високим. Більше того, більш високі значення Ki викликали майже однорідний розподіл потоків води через простий набір невеликих пір, всі з яких мали однаковий діаметр (12 мікрона). У той час як Ki був встановлений на рівні значення медії, розподіл потоку через пори було у високому ступенінеоднорідним і нефізіологічним. Деформируемая модель інтими пророкувала неоднорідне розподіл потоку при високому тиску (180 мм Hg). Пошкодження внутрішнього еластичного шару моделювалася введенням великих пір (до 178 мікрон). Драматичне збільшення потоку через великі пори спостерігалося при зміні рідинної механічної середовища гладком'язових клітин біля великих пір, що має значення для гіперплазії інтими та атеросклерозу. Модель також передбачає, що рідинної shearstress на дні поверхні ендотеліальної клітини близько 10 дін/см2 що є рівнем, який може впливати на клітинну функцію /59 /.
Порушення бар'єрної функції пов'язано з ініціацією і прогресуванням атеросклерозу, хвороби фокальній природи, асоційованої з гемодинамікою. У даному дослідженні проникність ендотелію для макромолекул і електричний опір ендотелію вивчалися in vitro в монослоях, що піддавалися впливу порушених (наведених вбезлад) полів потоку, що моделювали просторові варіації при shear stress потоку, що виявляється в артеріальних біфуркації. Після 5:00 дії потоку області високого градієнта shear stress показали збільшення в 55 рази трансендотеліальной транспорту декстрану (молекулярна вага 70000) в порівнянні з контролями, де не було потоку. Області незбуреного повністю розвиненого потоку, в тому ж монослоепоказали 29-кратне збільшення. Електричний опір монослоя зменшувалася при контакті з потоком. Опір під час дії потоку і рівень змін опору монослоя після видалення потоку був найбільш низьким поблизу від нового підключення потоку (найбільш високі значення градієнта shear stress). Ці результати демонструють, що бар'єрна функція ендотелію і проникність ендотелію до макромолекулам регулюється просторовими варіаціями всилі shear stress in vitro /43 /.
Таким чином, турбулентність потоку і низький shear stress, а також високий градієнт стресу зрізу сприяють збільшенню проникності ендотелію.
6.2.2.Гіпертонія
Гіпертонія, фактор ризику атеросклерозу, збільшує поглинання ліпопротеїнів низької щільності стінкою артерії. Було використано комп'ютерне моделювання для ідентифікації фізичних факторів, якіможуть бути частково відповідальні за цей ефект. Потік рідини і перенесення маси в просвіті та стінці артерії розраховувалися за допомогою комп'ютера одночасно, повторюючи наскільки це було можливо попередні експериментальні дослідження, в яких поглинання LDL артеріальної стінкою вимірювалося в звичайних вирізаних артеріальних сегментах. Як при наявності потоку, так за його відсутності модель передбачає збільшення концентрації поляризації LDL в артеріальній стінці, коли артеріальний тискзростає з 120 до 160 мм Hg. Проте це веде тільки до невеликого збільшення в середній концентрації LDL в стінці артерії. Якщо значення проникності ендотелію до LDL варіюється спільно з внутрішньоартеріальному тиском, тоді модель передбачає збільшення поглинання LDL в 1.9-2.6 рази при більш високому тиску. Величини цього збільшення узгоджуються з експериментальними даними. Зроблено висновок, що концентраційні ефекти поляризації не можуть пояснити спостережувані ефекти посиленняпоглинання LDL при гіпертонії. Замість цього, ці дані узгоджуються із зв'язаним з тиском збільшенням проникності ендотелію для LDL /55 /.
Хоча добре встановлено, що гіпертонія є основним фактором ризику інсульту, складність цереброваскулярних проблем у зв'язку з гіпертонією зазвичай недооцінюється. Гіпертонія може викликати інсульт через багато механізмів. Висока внутрішньосудинне тиск веде до великих змін в ендотелії і функції гладком'язових клітин під внутрішньочерепних артеріях. Збільшений стрес в ендотелії може збільшити проникність бар'єра кров - мозок і локальну мультифокальні едему мозку. Пошкодження ендотелію і змінене взаємодія між клітинами крові та ендотелієм може привести до локального тромбоутворення та ішемічним пошкоджень.Фібриноїдний некроз може бути причиною лакунарних інфарктів і вутрімозгових геморагій. Більш того, гіпертонія прискорює процес атеросклерозу, Цим збільшуючи ймовірність пошкоджень мозку, пов'язаних із стенозом і освітою емболів, що походять з великих внутрішньомозкових судин, з дуги аорти і з серця. Адаптивні структурні зміни в опорі судин, що мають позитивне значення,зменшуючи напругу судинної стінки, можуть мати і негативне значення, збільшуючи периферичний судинний опір, який може утруднити колатеральних циркуляцію і збільшити ризик ішемічних подій у зв'язку з епізодами гіпотонії в дистальних по відношенню до стенозу областях. Гіпертонія є фактором ризику для васкулярної деменції /28 /.
Гіпертонія є відомим фактором ризику розвитку атеросклерозу, який характеризується ненормальною акумуляцієюліпопротеїнів низької щільності й інших, що походять з плазми молекул Метою цієї роботи було вимірювання накопичення маркера походять з плазми молекул пероксидази хрону (ПХ, 44 kDa), в інтимі і міді аорти щурів з хронічною гіпертонією. Транспорт ПХ у дворічних щурів зі спонтанною гіпертонією порівнювався з таким у того ж вік щурів лінії Wistar-Kyoto за умов, що кров'яний тиск істотно не змінювалося протягом 15 хв циркуляції ПХ. Накопичення в інтимі і профільконцентрації в медії ПХ були отримані на підставі аналізу залитих метакрилатів зрізів препаратів після реакції з 33 '-діамінобензідіном і Н 2. Про 2. Дані аналізувалися за допомогою математичної моделі макромолекулярного транспорту для кількісної оцінки проникності ендотелію і внутрішнього еластичного шару (ВЕС). Хронічна гіпертонія збільшує проникність ендотеліюбез зміни в ВЕС. Очевидний конвективний потік ПХ в інтиму у щурів з гіпертонією піднімав рівень ПХ в інтимі до концентрації більш високою, ніж концентрація ПХ в плазмі. Ці результати змушують припустити, що накопичення походять з плазми макромолекул, викликане обумовленої тиском конвекцією мінімізується в нормі наінтактною ендотелію. Подібні зміни викликаються сильним пошкодженням ліпополісахаридів, що змушує припустити, що ендотеліальніушкодження можуть бути пов'язані зі змінами транспорту при гіпертонії. Після або гострого, або хронічного пошкодження ендотелію, транспорт макромолекул в інтиму зростає, але ВЕС продовжує затримувати транспорт макромолекул далі інтими, що призводить до посиленого накопичення їх в інтимі /42 /.
Таким чином, гіпертонія сприяє збільшенню проникності ендотелію і накопичення ліпопротеїнів в інтимі.
6.2.3.Кратковременние зміни проникності при змінах в потоці поблизу артеріальної стінки.
Експерименти були проведені на свинях для перевірки гіпотези, що зміни в потоці поблизу артеріальної стінки від декількох хвилин до декількох годин, викликають адаптивні відповіді, які короткочасно підвищують проникність ендотелію. Після парентерального введенняблакитного барвника Еванса, гемодинаміка зовнішніх клубових артерій експериментальних тварин змінювалася з допомогою реверсивного стегнового шунта. Протягом 3:00 шунт відкривали і закривали з періодом від 1 до 180 хвилин. Потім тварини були вбиті і клубові артерії були сфотографовані з метою визначення розподілу поглинання пов'язаного з альбуміном блакитного барвника Еванса протягом часу дії барвника. Поглинання альбуміну зростала з часом таким чином, якийможе бути пояснений на підставі a priori моделі адаптивного відповіді проникності, з константою часу близько години /17 /.
Таким чином, зміни в потоці поблизу артеріальної стінки короткочасно підвищують проникність ендотелію.
6.3.Бактеріальная інфекція.
Chlamydia pneumoniae була ідентифікована і асоційована з патогенезом множинного склерозу і хвороби Альцгеймера,хоча зв'язок цього організму з цими захворюваннями залишається суперечливою. Висунуто гіпотезу, що один з потенційних шляхів інфікування проходить через комплекси з'єднань ендотельного бар'єру між кров'ю і мозком. C. Pneumoniae є респіраторним патогенном, але бере участь в атеросклерозі, хвороби коронарних артерій і нейровоспалітельних станах. Інфекція C. Pneumoniae може вести до пошкодження ендотелію,змінам в з'єднаннях і руйнування бар'єру між кров'ю і мозком. Було показано, що інфекція C. Pneumoniae клітин людського мікросудинного ендотелію призводить до збільшеної експресії білків паска зчеплення: бета - Катенін, N - кадхеріна і VE - кадхеріна і зменшеною експресії щільного білка з'єднань окклюдіна, як показали іммуноцітохімія і Western blot аналіз. Ці події можуть лежати в основі механізму регуляції парацеллюлярной проникності іпідтримки інгеральності бар'єру протягом інфекції C. Pneumoniae, асоційованої з нейропатології, такими, як множинний склероз і хвороба Альцгеймера /36 /.
6.4.HDL
Смерть апоптичних клітин, наступна за пошкодженням судинного ендотелію, як передбачається, грає важливу роль в патогенезі атеросклерозу. Продемонстровано, що ліпопротеїни високої щільності, основна антиатерогеннихфракція ліпопротеїнів, захищає ендотеліальні клітини проти апоптозу. HDL блокують мітохондріальний шлях апоптозу шляхом інгібування дисипації мітохондріального потенціалу (дельтапсі (m)), генерації активних радикалів кисню та звільнення цитохрому с в цитоплазму. Як наслідок, HDL запобігає активацію каспаз 9 і 3 і апоптичні зміни в плазматичних мембранах, такі, як збільшення проникності і транслокація фосфотіділсеріна. Обробка ендотеліальних клітин HDL індукуєактивацію протеїн кінази Akt, всюдисущого трансдуктор антіапоптіческіх сигналів, і веде до фосфорилювання BAD, основного субстрату Akt. Супресія Akt активності як wortmannin, так і LY-294002 або домінантним негативним Akt мутантом знищують антіапоптіческій ефект HDL. Два біоактивних лізосфінголіпіда, присутні в HDL частинках, сфінгозілфосфорілхолін і лізосульфатід, повністю імітують ефект HDL, блокуючи мітохондріальний шлях апоптозу і дієво активуючи Akt. Таким чином,отримані дані ідентифікують HDL, як переносник ендогенних факторів виживання ендотелію і змушують припустити, що інгібування ендотеліального апоптоза HDL - ассоцірованного лізосфіголіпідамі може представляти важливий і новий аспект антиатерогенной активності HDL /41 /.
6.5.Гепран сульфат пртеоглікани.
Гепаран сульфат протеоглікани (HSPGs) є ключовими компонентами субендотеліального матриксу, який граєважливу роль в збірці і структурі базальної мембрани, регуляції проникності базальної мембрани, активності фактора росту і клітинної адгезії. Зміст (HSPGs) зменшується при запаленні, атеросклерозі і діабеті. Недавні дослідження показали, що HSPGs негативно регулюються атерогенннимі молекулами і позитивно регулюються антиатерогенні агентами. Екстрацелюлярний матриксних HSPG, перлекан (perlecan), як з'ясувалося, є ключовою мішенню регуляції цих агентів. По крайней мере,два рівні регуляції контролюють перлекан HSPG в матриксі: зміни в основний експресії протеїну або зміна у метаболізмі геперан сульфату. Атерогенні рівні LDL, oxLDL і лізолецітіна зменшують не тільки основний синтез білка, але також збільшують деградацію гепаран сульфату шляхом стимулювання ендотеліальної секреції гепаранази. ApoE і apoE-HDL, за контрастом, збільшують вміст основного білка перлекана, також, як і сульфатування геперан сульфату. Збільшене змістперлекана в ендотеліальних клітинах асоційоване зі збільшеним антитромбін - зв'язуванням і антипроліферативну ефектом. Більше того, модуляція перлекана надає пряму дію на ріст гладком'язових клітин. Таким чином, модуляція ліпопротеїнами судинного перлекана може грати ключову роль в модуляції атерогенезу /44 /.
6.6.Кініни.
При іспользаніі препаратів з людських судин, отриманих аутопсії іспецифічних антитіл, спрямованих до пептидним послідовностей кінінової B1 і B2 рецепторів, продемонстрована локалізація цих рецепторів в людській судинній системі. У великих еластичних артеріях і венах кінінової рецептори присутні тільки в ендотеліальних клітинах, в той час як у всіх м'язистих артеріях і артеріолах, ці рецептори присутні як в ендотеліальних клітинах, так і в гладком'язових клітинах. Ідентифікація кінінової рецепторів в людських судинахпідтверджує положення, що кініни можуть модулювати як судинну проникність, так і контрактільность. Епізодичне виявлення кінінової рецепторів при гістологічних дослідженнях при плямистої атероматозної хвороби в коронарної, стегнової і черевної артеріях допомогло в з'ясуванні ролі цих рецепторів у найбільш звичайних хворобах людських кровоносних судин. Інтенсивне мічення B1 рецепторів спостерігалося в ендотеліальних клітинах, пінистих макрофагах, запальних клітинах іфібробластах в потовщеною інтимі бляшки, так само, як в гладком'язових клітинах підлягає медії. Імунореактивних B2 рецептори також спостерігалися в цих клітинах, але зі зменшеною інтенсивністю. Інтенсивне імунно - мічення B1 рецепторів в цих областях змушує припустити, що воно може бути індуковано атероматозної хворобою, і що антогоністи рецепторів B1 можуть мати терапевтичне значення /47 /.
6.7.Ліпопртеін - ліпаза.
Механізми, відповідальні за накопичення ліпопротеїнів низької щільності були досліджені на новій моделі перфузованої аорти хом'яка. Для цього створено метод вивчення потоку в реальному часі в індивідуально перфузіруемих артеріях; кожна артерія служила як свій власний контроль. Рівні накопичення і витоку LDL роздільно визначалися за допомогою кількісної флуоресцентної мікроскопії. Перфузія артерій буфером з ліпопротеїн ліпазою (LpL) збільшувала акумуляцію LDL в 5 разів шляхомзбільшення утримання LDL в артеріальній стінці. Цей ефект був блокований гепарином і моноклональними антитілами, спрямованими проти аміно - термінального кінця аполіпопротеїну B (apo B). Це змушує припустити, що специфічні області apo B беруть участь у накопиченні LDL в артеріях. Також було досліджено дію гідролізу багатих тригліцеридами ліпопротеїнів на ендотеліальну бар'єрну функцію. Проникність ендотеліального шару вивчалася з використанням водорозчинних молекулфлуоресцентно міченого декстрану. Коли LpL була додана до гіпертрігліцерідеміческой плазмі, накопичення декстрану в артерії збільшилася більш ніж в 4 рази. Швидка витік LDL з артеріальною стінки вказує, що збільшена проникність ендотеліального шару є первинним механізмом під час збільшеного ліполізу. Ці дані можуть мати відношення до спостерігається зв'язку між збільшеною після прийому їжі ліпемії і атеросклерозом /50 /.
6.8.Ненасищенниежирні кислоти і TNF.
Фактори, що впливають на розвиток атеросклерозу, включають метаболічні зміни, викликані певними ліпідами і запальними цитокінами. Для перевірки гіпотези, що спільне присутність ненасичених жирних кислот і запальних цитокінів може посилити їх пошкоджують ефекти, культивовані ендотеліальні клітини оброблялися лінолевої кислотою (18:2) та /або TNF в періоди часу до 24 годин. Порушення в метаболізміендотеліальних клітин визначалися за допомогою вимірювання клітинного окислювального стресу, індукованого окислювальним стресом ядерного чинника kappa B (NF-kappa B) і kappa B-пов'язаної транскрипції, внутрішньоклітинного рівня кальцію і ендотеліальної бар'єрної проникності. Ці зміни були перехресно посилені як 18:2 і TNF в порівнянні з 18:2 і TNF окремо. За контрастом спільне вплив 18:2 і TNF НЕ потенціювати ефект опосередковані 18:2 або TNF окремо на NF-kappaактивацію або NF-kappa B-пов'язану транскрипцію. Передобробка вітаміном Е зменшували 18:2 і /або TNF-опосередковану дисфункцію ендотеліальних клітин. Ці результати змушують припустити, що певні ненасичені жирні кислоти можуть потенціювати TNF-опосередковану дисфункцію ендотеліальних клітин і що окислювальний стрес може бути частково відповідальний за ці метаболічні події. Ці дані можуть мати програми для розуміння ліпід - опосередкованих запальних відповідей приатеросклерозі /60 /.
6.8.Слой, пов'язаних з мембраною ендотеліальних клітин протеогліканів, глюкозаміногліканів та асоційованих білків плазми.
Ендотеліальні клітини вкриті поверхневим шаром асоційованих з мембраною протеогліканів, глікозаміногліканів, глікопротеїнів, гліколіпідів та асоційованих білків плазми. Цей шар може лімітувати транспорт розчинів. Визначалися розміри і властивості цього транспорту вендотеліальному поверхневому шарі (ЕРС) ізольованих артерій. Мезентеріальні малі артерії щура (діаметром приблизно 150 мікрон) каннуліровалі з двоствольними піпетками на вхідному кінці і звичайної піпеткою на вихідному кінці. Динаміка та локалізація внутрішньоартеріальної флуоресценції FITC-мічених декстранів (FITC-Deltas) і DiI барвника в ендотеліальної мембрані визначалися за допомогою конфокальної мікроскопії. Великі FITC-Delta (148 kDa) заповнювали центральний об'єм всередині артерій впротягом 1 хв, але були виключені з області шириною 2.6 + /- 0.5-мікрона ендотелію з боку посудини протягом 30 хв перфузії барвника. Середні FITC-Delta (50.7 kDa) повільно проникали в цю ЕПС, але не проникали в судинну стінку. Малі FITC-Delta (4.4 kDa) швидко проходили ЕРС і акумулювалися в судинній стінці. Пролонговано освітлення флуорохромами яскравою ртутної лампою руйнувало зону приблизно в 3 мікрона для FITC-Delta 148 протягом декількох хвилин. Це дослідженнядемонструє присутність товстого ЕРС шару, який вносить вклад в бар'єр проникності для розчинів. Шар чутливий до фототоксичності стресу, і його пошкодження може бути раннім подією в атерогенезе /64 /.
Таким чином, проникність ендотелію для розчинених речовин залежить від їх заряду і молекулярної маси. Її збільшують дефіцит магнію, оксістероли і запалення. Гемодінамічесіе фактори, бактеріальна інфекція, ліпопротеїн - ліпаза, певніненасичені жирні кислоти, цитокіни і кініни, можуть збільшувати проникність ендотелію, у той час як ліпопротеїни високої щільності, гепаран сульфат протеоглікани і примембранних шар ендотеліаьних клітин зменшують її.
7.Апоптоз і проникність ендотелію.
Кількісні взаємовідносини між динамікою кількості клітин (клітинні мітози і смерть клітин) і проникністю для макромолекул вивчалися на рівні індивідуальнихендотеліальних клітин (ЕК) грудної аорти дорослих самців щурів Sprague-Dawley. Експерименти були виконані на препаратах зразків аорти після внутрішньовенного введення пероксидази хрону (ПХ). ЕК, що знаходяться в стані мітозу, ідентифікувалися шляхом забарвлення гематоксиліном; вмираючі або загиблі ЕК, містять цитоплазматичний імуноглобулін G, визначалися за допомогою непрямої іммуноцітохіміі, а ендотеліальна проникність для ПХ візуалізувалися за допомогою світловоїмікроскопії. Кількісні дані про внесок мітозів і смерті ЕК в ендотеліальну проникність для ПХ були отримані на тих же самих тварин. Хоча ЕК в стані мітозу і вмираючі ЕК не часто зустрічалися, абсолютна більшість цих клітин були пов'язані з фокальним пропусканням ПХ. На частку цих перебувають у стані мітозу і вмираючих клітин, проте, доводилося тільки сранітельно невелика частина від загального числа місць підвищеної проникності, що вказує на те, що проникнення 4-5 нм ПХтакож відбувається в нормальних ЕК, морфологічно не визначених у стані мітозу або смерті. Відсотки місць проникності, пов'язаних з мітозів або клітинної смертю, були вищі для 6 нм альбуміну або для 22 нм ліпопротеїну низької щільності, які ймовірно не можуть перетнути нормальні з'єднання і використовують проникні з'єднання під час зміни числа клітин, як свій основний шлях проникнення через ендотеліальнийбар'єр /7 /.
Різні форми клітинного пошкодження, індукованого імунними ефекторними клітинами, аберантних метаболічними процесами, хемотерапевтичних ліками або температурними зрушеннями призводять до загальних морфологічних змін, що складається в освіті та скиданні мембранних везикул з поверхонь пошкодженої клітини, тобто апоптозом. Це динамічна поведінка поверхні клітинної мембрани залежить від руйнуванняцитоплазматичних мікротубул. Спільно зі зміненою морфологією поверхні клітини певні фізіологічні та біохімічні події також пов'язані з ушкодженням клітини. Вони включають зміни в проникності мембрани, збільшене споживання кисню і фрагментацію ДНК. Однак, треба визначити експериментально які з цих біологічних змін визначають необоротне пошкодження клітини і /або програмовану смерть клітини. Селективне пошкодження клітини і її смерть є метоюбагатьох терапевтичних прийомів, спрямованих на руйнування ракових клітин. З іншого боку, запобігання ушкодження клітини бажано при аутоімунних захворюваннях, таких, як lupus erythematosus, тіроідіт, інсулін - залежний діабет та багатьох інших. Пошкодження судинного ендотелію може грати роль не тільки при тромбозі, атеросклерозі і гіпертонії, але також може сприяти розповсюдженню метастазів пухлинних клітин /32 /.
Інкубація бичачої аорти, також яклюдських ендотеліальних клітин з пупкової вени з або окисленими, або нативними ліпопротеїнами низької щільності в присутності слідів міді індукує морфологічні зміни в клітинах і фрагментацію хроматину, характерні для програмованої клітинної смерті. Стиснення клітин ставало очевидним через 6-8 годин інкубації і, безсумнівно, супроводжувалося звільненням лактам - дегірогенази - маркера клітинної проникності. Конденсація ядерного хроматину і внутрінуклеосомальная сегментаціябули продемонстровані фарбуванням по Hoechst та гель - електрофорезом відповідно. Таким чином, індукуючи активну смерть ендотеліальних клітин, окислений ліопротеін низької щільності може негативно впливати на тканинній гомеостаз ендотелію і тому сприяти розвитку атеросклеротичних бляшок /52 /.
Реактивні радикали кисню (РРК) викликають апоптозну клітинну смерть у різних типів клітин. У клітинній стінці РРК можутьпродукуватися макрофагами в атеросклеротичної бляшці або можуть діяти на ендотелій після адгезії моноцитів або лейкоцитів. Більш того, РРК ендогенно синтезуються NAD (P) H оксидаза ендотеліальних і гладком'язових клітин. Збільшення продукції РРК є раннім маркером процесу атерогенезу, припускаючи зв'язок між РРК і апоптозом. В ендотеліальних клітинах ендогенна генерація індукується різними прозапальних і проатеросклеротіческімі факторами, такими як ангіотензин 11oxLDL і фактор некрозу пухлин альфа, які все викликають програмовану клітинну смерть. Синтез РРК тому причинно пов'язаний з індукцією апоптозу, оскільки антиоксиданти запобігають смерть ендотеліальних клітин. Видається, що проапоптозние ефекти ендогенних РРК ендотеліальних клітин включають вплив на проникність мітохондріальних мембран, що призводить до вивільнення цитохрому с, який, врешті-решт, активує каспаз. По контрасту з проапоптозние активністю РРК вендотеліальних клітинах в судинних гладком'язових клітинах ендогенні РРК сприяють клітинної проліферації та гіпертрофії і не впливають на клітинну виживання. Однак високі концентрації ендогенних РРК також стимулюють апоптоз гладком'язових клітин, як показано для інших клітинних типів через активацію р53. Розглянуті спільно ці ефекти ендогенних РРК можуть дати ключ до розуміння антиатеросклеротичні ефектів антиоксидантів, виявлених в експериментальнихдослідженнях: збільшення виживаності ендотеліальних клітин в комбінації з інгібуванням проліферації гладком'язових клітин блокує два дуже важливих події в патогенезі атеросклерозу /13 /.
Гіпергомоцистеїнемія являє собою незалежний фактор ризику атеросклерозу, але механізми, що ведуть до клітинної дисфункції, залишаються невідомими. При використанні клітин ECV304 було виявлено, що гомоцистеїн спільно з міддю володіють цитотоксичними ефектами (втратаклітинної адгезії, збільшена проникність для PI, поява морфологічно апоптозних клітин). Ця форма апоптозу, інгибіруємой Z-VAD-fmk, пов'язана з втратою мітохондріального потенціалу, цитозольним звільненням цитохрому с, активацією каспаз - 3 деградацією полі (АДФ-рибоза) полімерази і внтрінуклеосомной ДНК фрагментацією. Однак здатність гомоцистеїну спільно з Cu2 + індукувати апоптоз зменшується у міру збільшення часу предінкубаціі. Оскільки позитивна кореляція булазнайдена між тривалістю часу культивування перед інкубацією і посиленням активності гамма-глутаміл транспептидази, було цікаво з'ясувати, чи бере участь гамма - глутаміл - транспептидаза в контролі над індукованим спільною дією гомоцистеїну та Cu2 + апоптозом. Тому ECV304 клітини обробляли або ацівіціном (acivicin) або дексаметазоном, інгібуючи або стимулюючи гамма - глутаміл - транспептидази відповідно. В ECV304 клітинах і в ендотеліальних клітинах пупкової венилюдини ацівіцін сприяє индуцированному спільною дією гомоцистеїну та Cu2 + апоптозу, в той час як дексаметазон протидіє процесу апоптозу. Ацівіцін і дексаметазон також здатні модулювати клітинну смерть у ECV304 клітин, обробленими антипухлинних засобами. Участь гамма-глутаміл-транспептидази у контролі апоптозу не обмежується гомоцистеїну, але також зачіпає інші клітинні компоненти /4 /.
Таким чином, великімолекули, такі, як ліпопротеїни, проникають через ендотелій в основному в місцях мітозів або загибелі клітин. Апоптоз (програмовану клітинну смерть) індукують активні радикали кисню, oxLDL, ефекторні імунні клітини і різні прозапальні фактори, такі, як фактор некрозу пухлин. Гамма - глутаміл - транспептидаза бере участь у контролі апоптозу, зокрема викликаним гомоцистеїну.
8.Проніцаемость артеріальної стінки для ліпопротеїнів.
Потік LDL в артеріальну стінку (в молях LDL на площу поверхні за одиницю часу) визначається двома головними детермінантами, концентрацією LDL в плазмі і проникністю артеріальної стінки. LDL входить в артеріальну стінку, як інтактні частки шляхом транспортування до везикулах через ендотеліальні клітини та /або шляхом пасивного проходу через пори в або між ендотеліальними клітинами. Оцінки in vivo LDL проникності для нормальноїартеріальної стінки варіюють між 5 і 100 nl/cm2/час. У лабораторних тварин місцеві варіації проникності артеріальної стінки пророкують ступінь розвитку наступного, індукованого дієтою, атеросклерозу. Більш того, механічне або імунологічне пошкодження артеріальної стінки збільшує LDL проникність і супроводжується прискореним розвитком експериментального атеросклерозу. Це підтверджує ідею про те, що збільшена проникність для LDL, подібно збільшеної концентраціїLDL в плазмі збільшує ризик атеросклерозу. Гіпертонія, куріння, генетична схильність, атеросклероз і малий розмір LDL можуть збільшити проникність артеріальної стінки для LDL і тим самим збільшити ризик прискореного розвитку атеросклерозу. Гіпотеза, що ризик атеросклерозу може бути зменшений шляхом поліпшення бар'єрної функції артеріальної стінки для LDL, відкрита для дослідження. Агенти, які прямо модулюють LDL проникність для артеріальної стінки in vivo, чекають своєїідентифікації /40 /.
Помірно окислені ліпопротеріни низької щільності (mox-LDL) беруть участь у ранніх атерогенних відповідях ендотелію і збільшують проникність ендотелію через невідомий сигнальний механізм. Показано, що (1) в змикаються ендотеліальних клітинах, підданих впливу mox-LDL, але не нативних LDL, протягом хвилин індукується освіта Актинові стресових волокон і міжклітинних проміжків, що ведуть дозбільшення ендотеліальної проникності, (2) moxLDL індукує минуще зменшення зміст фосфатази в легенях міозіновихцепях (ЛМЦ), яке відбувається паралельно зі збільшенням ЛМЦ фосфорилювання ЛМЦ, (3) фосфорильовані ЛМЦ, стимульовані moxLDL, включаються в стресові волокна; (4) перебудова цитоскелету і фосфорилювання ЛМЦ ингибируются С3 трансферазой з Clostridium botulinum, специфічним інгібітором Rho кіназ, і (5) moxLDL не збільшують внутрішньоклітинну концентраціюCa (2 +). Отримані дані вказують, що контракція ендотеліальних клітин здійснюється через активацію Rho та її ефектори Rho кіназу, яка інгібує ЛМЦ фосфатазу та осфорілірует ЛМЦ. Передбачається, що цей новий сигнальний шлях mox-LDL може бути використаний для запобігання атеросклерозу /14 /.
Мікроальбумінемія пов'язана зі збільшеним ризиком атеросклерозу в осіб з діабетом. Висунуто гіпотезу, що трансендотеліальной обмін іпопротеінамі збільшений у діабетиків,що, можливо, пояснює збільшене накопичення у них ліпопротеїнів і таким чином атеросклероз. Трансендотеліальной обмін ліпопротеїнів низької щільності вимірювався з використанням ізотопної техніки у людей. Аутологічних йодованої J -131 LDL були ін'єктовані внутрішньовенно, і погодинної їх вихід був обчислений як індекс трансендотеліальной обміну. Не зареєстровано різниці в трансендотеліальной обміні між особами з мікроальбумінеміей та особами з нормоальбумінеміей. По контрасту булавиявлена позитивна кореляція між трансендотеліальних LDL обміном і концентрацією інсуліну в плазмі. Ця кореляція не залежала від віку, статі, кров'яного тиску, концентрації ліпопртеінов в плазмі, розміру LDL, індексу маси тіла, об'єму плазми, використання медикаментів, і вона навряд чи викликана зміненої експресією LDL рецепторів в печінці або глікозилювання LDL. Трансендотеліальной обмін LDL не асоційований з мікроальбумінеміей, але можливо з гиперинсулинемией /26 /.
Відкладення ліпідів більш часто мають місце вниз за течією крові від місць розгалуження, ніж вгору за течією у незрілих кроликів і в людській аорті, але протилежний тип спостерігається в зрілих судинах. Ці розподілу корелює просторово зі пов'язаної з віком проникністю аорти у кролів і можуть визначатися ними. Зрілий, але не незрілий тип проникності залежить від ендогенного синтезу окису азоту. Недавні дослідження показали тип проти течії у деяких зрілих кроликів, але за течією в інших. Показано, що транспорт у зрілих кроликів значно ухиляється в бік типу за течією днем в порівнянні з ранком, і переходить від типу за течією до типу проти течії при віці 21 місяці у кроликів лінії Murex, але при віці в два рази більшому у кроликів лінії Highgate. Ефект часу дня не пояснюється утворенням окису азоту, визначеним за рівнем нітратів і нітритів, і не корелює зі звуком артеріального каналу, визначеному за периферичної пульсової хвилі. Ефект лінії не може бути пояснений змінами освіти окису азоту, а також відмінностями в структурі стінки. Ефект часу дня і лінії кроликів на проникність дає корисний інструмент для дослідження механізмів проникності і може мати значення для вивчення хвороби людини /56 /.
Гіперхолестеринемія викликає ендотеліальну дисфункцію, "клеймо" атеросклеротичного процесу, модулюючи експресію генів в судинних ендотеліальних клітинах. Шляхом диференціального аналізу проявів, вивчався ефект високих концентрацій нативного ліпопротеїну низької щільності на експресію ендотеліальних генів. Рівні мРНК лізілоксідази, ензиму бере участь в утворенні поперечних зшивок в колагену і еластину, знижувалися в ендотеліальних клітинах при обробці LDL в доза - залежним і час-залежним образами. Це зменшення експресії лізілоксідази було пов'язано зі зменшенням активності лізілоксідази. Інгібування активності лізілоксідази LDL або бета-амінопропіонітрілом, інгібітором лізілоксідази, збільшувало проникність ендотелію. Цікаво, що зменшення експресії лізілоксідази (в 35 рази) спостерігалося in vivo в судинній стінці гіперхолестеролеміческіх свиней. Ці дані змушують припустити, що ендотеліальна дисфункція, викликана гіперхолестеринемією, вносить внесок в освіту атеросклеротичних бляшок /48 /.
Транспорт макромолекул, таких як ліпопротеїни низької щільності, через ендотелій та їх акумуляція в артеріальній стінці є ключовими подіями в атерогенезе. Моделювався потік рідини в посудині і стінці судженої осесиметричної трубки, що імітує стенозірованной артерію, і потім використовувався цей зразок потоку для вивчення транспорту маси LDL з крові в артеріальну стінку. Здвоєний аналіз потоку крові в посудині і трансмурального потоку рідини був проведений за допомогою моделі Brinkman, яка є розширенням рівнянь Navier-Stokes для пористого середовища. Цей здвоєний підхід має перевагу в порівнянні з традиційним аналізом цієї проблеми, який використовує, можливо, нереалістичні граничні умови на кордоні кров - судинна стінка; замість цього встановлювалися більш природне гранична умова тиску на адвентіціальной vasa vasorum і допускалися варіації в проникності стінки, пов'язані з бляшкою. Чисельні ускладнення, пов'язані з конвекційним домінуючим потоком маси (низька здатність до дифузії LDL) усувалися за допомогою методу Petrov-Galerkin. Цей новий рідина - плюс-пори метод застосовувався для умов, типових для транспорту LDL в стенозірованной артерії з 75% скороченням просвіту. Результати показали підвищену концентрацію LDL вниз за течією від. стенозу. Більш висока проникності Darcia